VELIKOST A KONCENTRACE ČÁSTIC MĚŘENÁ NEJPOKROČILEJŠÍM DLS PŘÍSTROJEM NA TRHU – ZETASIZEREM ULTRA OD MALVERN PANALYTICAL

Malvern Panalytical Limited

Zetasizer Ultra se od svého uvedení na trh v roce 2018 stal unikátním nástrojem pro stanovení koncentrace  organických částic menších než 40–50 nanometrů v řádu minut. Obdobné schopnosti v podobě rychlého stanovení velikosti a koncentrace částic do té doby nabízela pouze přístrojová řada NanoSight (Malvern Panalytical), ovšem s výše uvedeným omezením detekce organických částic. Zetasizer Ultra navíc disponuje širším rozsahem měřitelných koncentrací a velikostí částic. Ostatní nové vlastnosti Zetasizeru Ultra byly popsány v tomto článku, který vyšel v Chemagazínu 4/2018 [1]. Ze srovnání obou výše uvedených technik na příkladu liposomů vyplývá, že obě techniky poskytují obdobné výsledky v oblasti překryvu koncentračních rozsahů – viz aplikační poznámka fi Malvern Panalytical „Characterizing the size and concentration of liposomes using multi-angle dynamic light scattering“ [2]. Dále bude představeno použití Zetasizeru Ultra pro stanovení virů v porovnání s klasickou ELISA metodou.

Koncentrace adeno-asociovaných virů pomocí víceúhlového DLS měření

Pro vývoj a produkci viru je důležité znát koncentraci viru v různých stádiích procesu, optimalizovat použitý klon a výtěžky produkce. Například případy, jako je screening klonů, optimalizace multiplicity infekce (MOI) a adaptace metod buněčné kultury, jsou případy, kdy je zajímavá koncentrace neboli titr viru.
Dynamický rozptyl světla (DLS) může být použit ve vývoji viru, k měření léčivé látky nebo ve screeningové funkci k oddělení dobrých a stabilních vzorků od vzorků s kontaminanty nebo agregáty. Díky novému měření koncentrace částic na víceúhlových DLS (multi-angle DLS = MADLS), které je k dispozici na Zetasizer Ultra, je nyní možné během několika minut získat distribuci velikosti i koncentraci částic v jednotlivých populacích daného vzorku.
Irská farmaceutická společnost Allergan laskavě sdílí data ze svého vyhodnocení Zetasizeru Ultra, jsou uvedeny příklady tří vzorků adeno-asociovaných virů (AAV). Výsledky koncentrace jsou porovnány s výsledky titru viru založených na ELISA testu kapsid.

Metody

Vzorky byly měřeny pomocí nízkoobjemové křemenné kyvety (ZEN2112). Měření byla prováděna na přístroji Zetasizer Ultra za použití měření koncentrace částic, které poskytuje jak distribuci velikosti částic pomocí MADLS, tak koncentraci v jednotlivých populacích (pících). Před měřením musí uživatel poskytnout následující parametry:

• Materiál vzorku – byla zvolena bílkovina (tvoří kapsidu viru).
• Rozpouštědlo/pufr; zpočátku voda, ale viskozita byla později zpřesněna pro získání správné velikosti a tím i koncentrace částic. Přesnost měřené velikosti je rozhodující pro výpočet koncentrace částic. Viskozita pufru byla stanovena nepřímo – úpravou viskozity pro získání přesné velikosti přidaných standardních polystyrenových latexových částic 60–200 nm [3].
• Četnost fotonů rozptýlených pufrem byla měřena na zpětném úhlu ve středu použité cely.

Doba trvání tří opakovaných měření je kratší než 4 minuty.

Výsledky

Distribuce velikosti částic vážené podle intenzity pro tři vzorky AAV jsou uvedeny na obrázku 1, graf A až C. Odpovídající koncentrace částic jsou uvedeny na obrázku 2, graf C až F. Referenční vzorek ATCC AAV2 zobrazený na obrázku 1, graf A, obsahuje agregáty, což není překvapivé, protože tento vzorek byl rozmražen a díky malému dostupnému objemu byl vložen přímo do kyvety bez jakékoli filtrace. I přes přítomnost agregátů však koncentrace částic na bázi MADLS dává hodnotu koncentrace (1,12 x 1012 částic/ml), která dobře odpovídá ELISA testu kapsid (0,92 x 1012 částic/ml). Další podrobnosti o agregovaných koncentracích viz tabulka 1. U dvou vzorků AAV Allerganu je detekováno mnohem menší nebo nulové množství agregátů a, jak je vidět v tabulce 1, hodnoty koncentrace virového píku v obou vzorcích dobře korelují s výsledky ELISA kapsid.

Za účelem srovnání variace koncentrace byl vypočítán variační koeficient (%CV) na základě výsledků pro každé opakované měření z vypočtené standardní odchylky a střední hodnoty.

Při porovnání výsledků uvedených v tabulce 1 se ukazuje, že referenční vzorek ATCC AAV2 má největší variační koeficient koncentrace virové populace. To je způsobeno přítomností agregátů v tomto vzorku, které ovlivňují pozici vrcholu populace AAV. Porovnáme-li opakovatelnost velikosti píku na obrázku 1A s některým z ostatních vrcholů virové populace na obrázku 1B nebo 1C, můžeme vidět, že distribuce v posledním grafu se více překrývají a jsou opakovatelnější. To má přímý vliv na opakovatelnost měření koncentrace. Oba vzorky Allergan AAV vykazovaly asi 15% opakovatelnost, v přítomnosti žádných či velmi málo agregátů ve vzorku.

Závěr

Prezentovaná data ukazují, že koncentrační měření na bázi MADLS v přístroji Zetasizer Ultra může poskytnout jak distribuci velikosti ve vzorcích virů AAV a tím informaci o stavu agregace vzorků, tak i poskytnout koncentraci hlavní populace (virů) a dalších populací (přítomných agregátů). Každé opakování měření trvá méně než 4 minuty. Vzorek může být uchováván uzavřený pro celé měření uvnitř kyvety, takže riziko kontaminace je minimální a riziko expozice obsluhy je též minimalizováno.
Na závěr bylo během testování zjištěno, že je důležité použít správnou viskozitu vzorku, aby bylo zajištěno co nejpřesnější měření koncentrace částic. Viskozita vzorku může být měřena pomocí viskozimetru nebo v samotném přístroji Zetasizer Ultra pomocí latexových částic standardu [3].
Literatura
[1] Novinky v technice dynamického a elektroforetického rozptylu světla pro měření velikosti, zeta potenciálu a nově koncentrace částic v disperzích, Chemagazín 2018, XXVIII (4), s. 28.
[2] Charakterizace velikosti a koncentrace liposomů s využitím víceúhlového DLS měření; aplikační poznámka Malvern Panalytical (online).
[3] Stanovení viskozity rozpouštědla pomocí dynamického rozptylu světla; aplikační poznámka Malvern Panalytical (online).
Ing. Michal DUDÁK PhD., ANAMET s.r.o.,
dudak@anamet.cz