Gelová permeační chromatografie
Gelová permeační chromatografie (GPC), někdy také označovaná jako size exclusion chromatography (SEC) je separační metoda založená na principu rozdílné velikosti a tvaru molekuly, při které separace téměř nezávisí na fyzikálně-chemických vlastnostech dělených látek. Stacionární fáze je tvořena inertním nerozpustným polymerním gelem, který vytváří síť s definovanou velikostí pórů gelu. Stacionární fáze je umístěna v koloně, kterou kontinuálně prochází mobilní fáze. Separační proces je primárně závislý na charakteru stacionární fáze (velikosti, tvaru, množství a relativním objemu pórů gelu), dále závisí na velikosti a rozložení částic stacionární fáze. Separační proces je také závislý na charakteru mobilní fáze a její průtokové rychlosti. Po nástřiku dělené látky do GPC systému, je vzorek unášen mobilní fází směrem k separační koloně. Dělené látky s malou relativní molekulovou hmotností mohou difundovat do pórů gelu, čímž dojde k jejich zpožďování vůči mobilní fázi. Oproti tomu látky s velkou relativní molekulovou hmotností nemohou difundovat do pórů gelu a jsou unášeny průtokem mobilní fáze směrem k detektoru nebo sběrači frakcí. Z toho vyplývá, že ze separační kolony budou nejdříve eluovat látky s velkou relativní molekulovou hmotností a jako poslední opustí kolonu látky s nejmenší relativní molekulovou hmotností.
GPC jako nástroj pro práci s polymery i purifikaci proteinů
Své uplatnění našla GPC především při stanovení relativních molekulových hmotností a distribuce molekulových hmotností syntetických polymerů a biopolymerů. Purifikace proteinů je odvětví ve kterém našlo GPC využití. Dalším odvětvím, ve kterém GPC našlo použití, je potravinářský průmysl, kde se využívá například při analýzách želatiny a škrobů.
Detektory pro gelovou permeační chromatografii
Detektor indexu lomu pro gelovou permeační chromatografii
Detektor indexu lomu neboli refraktometrický detektor je nejběžněji používaný detektor ve spojení s GPC/SEC systémy. Detektor indexu lomu je založen na měření změn indexu lomu mobilní fáze, která protéká měřící celou. Měření změn indexu lomu je diferenční, tj. měří se změna indexu lomu oproti referenční cele. Pomocí refraktometrického detektoru lze detekovat všechny látky, jejichž index lomu se dostatečně liší od indexu lomu mobilní fáze. Nevýhodou refraktometrického detektoru je závislost indexu lomu na teplotě a tlaku, a proto je teplota v refraktometrickém detektoru přísně regulována.
Při použití detektoru indexu lomu jako jediného detektoru v systému GPC/SEC lze určit relativní koncentrace různých datových řezů v píku vzorku, což v kombinaci s kalibrační křivkou umožňuje výpočet momentů relativní molekulové hmotnosti (Mn, Mw, Mz). Pokud je refraktometrický detektor kombinován s detektorem rozptylu světla a viskozimetrickými detektorem, je možné určit přesnou koncentraci vzorku v každém datovém řezu a s její znalostí vypočítat absolutní molekulovou hmotnost a vnitřní viskozitu. Získáme tak přesnou koncentraci vzorku v každém datovém řezu pomocí hodnoty dn/dc vzorku.
Firma MALVERN Panalytical používá v GPC systému OMNISEC REVEAL vysoce citlivý modul detektoru indexu lomu pro přesné měření koncentrace vzorku, popř. hodnoty dn/dc.
Detektor slouží k určení koncentrace vzorku. Jeho robustní průtoková cela je udržována v sérii s jinými detektory pro dosažení maximální citlivosti. Tento modulární diferenciální detektor indexu lomu je uložen v prostředí, ve kterém lze regulovat teploty až na 55 °C pro zlepšení základní stability signálu. Regulaci teploty lze také vypnout a pracovat za teploty okolního prostředím, například v chladné místnosti nebo chladícím boxu. Průtočná 9 μl měřicí cela minimalizuje rozšiřování pásma (band-broadening).
UV/Vis detektory pro gelovou permeační chromatografii
UV detektory pracují buď při pevné vlnové délce nebo lze vlnovou délku měnit v závislosti na analytu. Absorpce UV záření se řídí Lambert-Beerovým zákonem, podle kterého je množství absorbovaného záření funkcí počáteční intenzity záření, délky optické dráhy paprsku v kyvetě, koncentrace analytu a jeho molárního absorpčního koeficientu.
Použití UV detektoru je omezeno absorpcí eluentu při pracovní vlnové délce.
UV/Vis detektory můžeme rozdělit na ty s fixní vlnovou délkou, nejčastěji 254 nm a na detektory s nastavitelnou vlnovou délkou a nebo na UV/Vis DAD, tedy na detektory s diodovým polem, které zaznamenávají celé spektrum vlnových délek. Používají se jako detektor koncentrace vzorků z chromoforů a pro měření dA/dc.
Firma MALVERN používá v systému OMNISEC REVEAL DAD detektor s UV-fotodiodovým polem za účelem dosažení citlivého a přesného měření absorbance UV a viditelného světla. Současně měří všechny vlnové délky v rozsahu 190 až 900 nm pomocí 1024 diodového pole. Plně spektrální 2D a 3D displeje lze použít k identifikaci materiálů s různými spektry a vlnovými délkami maximální absorbance vzorku.
Viskozitní detektor
Viskozitní detektor je tvořen čtyřmi kapilárami sestavenými do „Wheatstoneova“ můstku. Pokud detektorem protéká pouze čisté rozpouštědlo ,jsou všechny kapiláry naplněny tímto rozpouštědlem. Když do viskozitního detektoru začne proudit eluát z GPC/SEC systému, začne tento eluát plnit kapiláry číslo 1, 2 a 4, zatímco kapilára číslo 3 obsahuje čisté rozpouštědlo. Díky zvýšení viskozity v kapilárách 1, 2 a 4 oproti kapiláře č. 3 dojde k tlakové nerovnováze ve „Wheatstoneově“ můstku, která je měřena tlakovým snímačem. Vstupní tlak (inlet pressure Pin) a diferenciální tlak jsou přímo úměrné specifické viskozitě polymerního roztoku.
Vzhledem k tomu, že měřené koncentrace polymerních roztoků jsou velmi nízké, je možno přímo stanovit limitní viskozitní číslo. Spojení refraktometrického a viskozitního detektoru poskytuje přesné stanovení molární hmotnosti pro všechny typy polymerů, na které lze aplikovat univerzální kalibraci. S viskozitním měřením lze získat vedle stanovení vnitřní viskozity a hydrodynamického poloměru i cenné informace o stupni větvení, které nejsou při měření se samotným refraktometrickým detektorem dostupné.
Sytém OMNISEC REVEAL od společnosti MALVERN je vhodným nástrojem citlivé a přesné měření vnitřní viskozity syntetických a přírodních polymerů a proteinů. Ten v rámci výše popsané konstrukce Wheatstoneova můstku obsahuje patentovaný jednorázový kapilární samovyvažovací můstek, který lze snadno vyměnit a dále automatický vyvažovací mechanismus pro dosažení maximální stability, citlivosti a robustnosti měření. Převodníky jsou vyrobeny z nerezové oceli 316 pro maximální kompatibilitu mobilní fáze s širokým rozsahem pH a koncentraci solí. Dále konstrukce obsahuje vysoce robustní diferenciální tlakový převodník pro omezení rizika poškození během provozu.
Detektory pracující na principu rozptylu světla
Dalším typem detektoru, kterým lze stanovit molární hmotnost vzorku, je detektor rozptylový. Během měření prochází laserový paprsek do kyvety s eluátem, který opouští chromatografickou kolonu. Dopadající primární laserový paprsek se rozptyluje o rozpuštěné molekuly analytu. Intenzita rozptýleného světla je úměrná velikosti částic, rozdílu indexů lomu a koncentraci částic. Molární hmotnost měřená rozptylovým detektorem se stanoví pomocí Rayleighovy rovnice, kterou lze zjednodušeně uvést ve tvaru:
kde R(θ) je intenzita rozptýleného světla na úhlu θ, C je koncentrace částic v roztoku, M je hmotnostní průměr molární hmotnosti a K je optická konstanta.
Pro výpočet molární hmotnosti je nutno stanovit R (θ) při nulovém rozptylovém úhlu. Toho lze dosáhnout použitím tzv. detektoru „Nízko úhlového rozptylu světla“ (Low Angle Light Scattering, LALS), což je detektor, který snímá rozptýlené světlo pod úhlem menším než 10° vzhledem k primárnímu paprsku.
Firma MALVERN ve svém systému OMNISEC REVEAL používá unikátní detektor rozptylu světla RALS/LALS. Tento detektor obsahuje pravoúhlý (RALS) a nízko úhlový detektor (LALS). RALS maximalizuje citlivost pro měření materiálů s nízkou molekulovou hmotností, zatímco LALS maximalizuje přesnost měření molekulové hmotnosti pro vzorky s vysokou molekulovou hmotností Mw. Detektor RALS snímá rozptýlené světlo pod úhlem 90°. Může měřit molekulovou hmotnost s vysokou citlivostí pro vzorky, které rozptylují světlo izotropně, tj. stejně ve všech směrech; nelze však měřit molekulovou hmotnost pro anizotropní rozptylovače (ovlivňované úhlovou závislostí).
- Detektor LALS sbírá rozptýlené světlo pod úhlem 7°. Může měřit molekulární hmotnost pro všechny molekuly, ale má nižší poměr signálu k šumu.
- Kombinací RALS a LALS detektorů lze měřit molekulovou hmotnost všech vzorků při maximalizaci odstupu signálu od šumu.
- Tato kombinace tak slouží pro citlivé a přesné měření absolutní molekulové hmotnosti syntetických a přírodních polymerů i proteinů.
STATIC LIGHT SCATTERING TECHNOLOGIES FOR GPC/SEC EXPLAINED
Více úhlové detektory
Další možností stanovení molární hmotnosti je měření rozptýleného světla pod různými úhly a následná extrapolace k „nulovému“ úhlu. V tomto druhém případě hovoříme o tzv. „Více úhlovém detektoru rozptylu světla“ (Multi Angle Light Scattering, MALS). Pomocí těchto rozptylových detektorů lze stanovit jak hmotnostní průměr molární hmotnosti, tak velikost částic (gyrační poloměr). MALS může měřit molekulovou hmotnost jak pro izotropní, tak anizotropní rozptylovače. Pro anizotropně rozptylující částice může také měřit poloměr otáčení (radius of gyration).
Firma MALVERN Panalytical používá detektory Viscotek SEC-MALS 20 a SEC-MALS 9.
Detektor SEC-MALS – 20 citlivě detekuje světlo pomocí rozptylového systému s 20 detektory uspořádanými od 12 do 164 stupňů s regulací teploty do 60 °C. Design vertikální průtokové cely zlepšuje přesnost a opakovatelnost měření a zajišťuje, že potřeba čištění čištění cely je významně snížena. Dvacetiúhlový detektor měří od méně než 1000 do více než 10^7 Daltonů s vynikající citlivostí a přesností. Vyžaduje přítomnost detektoru indexu lomu (RI) nebo UV detektoru a analogový výstup.
Detektor SEC – MALS 9 používá stejnou vertikální průtočnou kyvetu s radiálním optickým designem jako SEC – MALS 20 a také dosahuje vysoké citlivosti a nízkého odstupu signálu od šumu.
Pracuje s rozptylovými úhly 28°, 44°, 60°, 76°, 90°, 108°, 124°, 140°, 156°, objem průtočné cely je 63 mikrolitrů.
Kombinované detektory
Při detekci a charakterizaci chemicky heterogenních systémů, jako jsou vzorky biologického původu, směsi nízkomolekulárních látek a polymerů nebo kopolymery, je často nevyhnutelné současné využití více detekčních principů. V takových případech je nejjednodušší spojení dvou a nebo více detektorů do série.
Příkladem mohou být tzv. duální detektory, které současně měří absorpci světla při dvou
vlnových délkách, nebo UV absorpci a změny indexu lomu.
V moderních přístrojích se často setkáváme s kombinovanou detekcí umožňující stanovení absolutní hodnoty molárních hmotností polymerů a strukturální charakteristiky. Příkladem mohou být duální detektory spojující refraktometr (detekce koncentrace) a viskozimetr (detekce viskozity), refraktometr a detektor rozptylu světla a konečně i tzv. „triple“ a nebo i „kvatro“ uspořádání detektorů, které do série spojuje refraktometr, UV/Vis detektor, viskozimetr a rozptylový detektor.
MALVERN Panalytical je jediný výrobce systému gelové permeační chromatografie s komplexní integrovaným systémem až čtyř detektorů umístěných v jediném tepelně stabilizovaném bloku (OMNISEC RESOLVE).Tento ucelený systém je dodávaný společně se softwarem k ovládání, měření a vyhodnocení dat včetně diagnostiky.
