Charakterizace extracelulárních vezikul

Extracelulární vezikuly (EV) neboli exozomy se dostávají do popředí výzkumu díky svému terapeutickému a diagnostickému potenciálu. Jsou to malé membránové struktury uvolňované buňkami do jejich okolí, které se podílejí na mezibuněčné komunikaci, transportu molekul a dalších pro organismus důležitých funkcích. K jejich charakterizaci existuje řada analytických metod, které by se daly rozdělit na metody charakterizující extracelulární vezikuly ve smyslu částic a metody, které charakterizují jejich obsah. Mezi druhé zmíněné patří například metoda western blot pro detekci specifických proteinů, hmotnostní spektrometrie pro stanovení proteinového, lipidového a metabolomického obsahu, nebo PCR pro stanovení specifické nukleové kyseliny. Vzhledem k malým rozměrům extracelulárních vezikul existuje také celá řada přístupů pro jejich charakterizaci ve smyslu částic. Naše společnost ANAMET s.r.o. nabízí kompletní portfolio technik pro jejich charakterizaci, o kterých se dočtete níže.

Nanoparticle Tracking Analysis (NTA)

NTA je technologie používaná k měření distribuce velikostí a koncentrace částic v suspenzi. Využívá světelného rozptylu k detekci jednotlivých částic a sleduje jejich Brownův pohyb. Přepočtem se poté vypočítá jejich rozměr a koncentrace. Velkou výhodou této technologie je možnost měření suspenze částic s různým složením bez nutnosti znát index lomu částic, rovněž jí nedělají problém polydisperzní systémy. V našem portfoliu je tato technika zastoupena přístrojovou řadou NanoSight od společnosti Malvern Panalytical. Velikost částic je měřena v rozmezí 10–1000 nm a vezikuly (od 40 nm) jsou zobrazeny v reálném čase včetně video záznamu jejich pohybu. NanoSight také disponuje možností fluorescenčního měření při vlnové délce příslušného laserového modulu a tak lze i částečně určit fenotyp EV. Technologie NTA je díky svým vlastnostem naprosto ideální pro měření velikosti a koncentrace částic a NanoSight se tak stává předním nástrojem pro charakterizaci extracelulárních vezikul z hlediska velikosti, koncentrace a původu pomocí fluorescenčního značení.

Dynamický rozptyl světla (DLS)

DLS je metoda používaná k měření distribuce velikostí, koncentrace a zeta potenciálu EV na základě rozptylu světla. Tato metoda je vhodná pro analýzu částic v suspenzi, avšak hůře si poradí s polydisperzitou extracelulárních vezikul nebo s heterogenními vzorky. Námi nabízený DLS analyzátor ZetaSizer od Malvern Panalytical však potřebuje pro analýzu výrazně méně vzorku než výše zmíněná NanoSight. Výhodou je možnost měření zeta potenciálu, který poskytuje informace o povrchovém náboji vezikul. To je důležité pro pochopení stability vezikul v suspenzi a jejich interakcí s buněčnými membránami.

Elektronová mikroskopie (EM)

Velice rozšířenou metodou pro vizualizaci EV je elektronová mikroskopie, která nabízí vysoké rozlišení jednotlivých vezikul. Existují dva hlavní typy EM, které se používají: transmisní elektronová mikroskopie (TEM) a skenovací elektronová mikroskopie (SEM). SEM umožnuje detailní zobrazení povrchu EV a stolní SEM mikroskopy řady Phenom od Thermo Scientific s kryodržákem jsou univerzální volbou pro vaši laboratoř.

Průtoková cytometrie

Tato metoda umožňuje kvantitativní analýzu jednotlivých EV na základě jejich velikosti a povrchových markerů. Průtoková cytometrie využívá laserové světlo k detekci fluorescenčních značek navázaných na specifické proteiny vezikul a díky více detektorům lze také charakterizovat jejich fenotyp. FlowNanoanalyzer od NANOFCM je specifickým typem průtokové cytometrie navržený pro citlivou charakterizaci nanočástic včetně extracelulárních vezikul. Kromě rozptylu světla sloužícího k výpočtu velikosti částic na základě kalibrace SiO₂ standardy, zaznamenává také fluorescenční signál, ze kterého získává informaci o původu či složení částic.

Mikroskopie atomárních sil (AFM)

AFM umožňuje zobrazování EV s nanometrickým rozlišením, což poskytuje detailní informace o jejich morfologii, velikosti, tvaru a povrchových vlastnostech. Pomocí AFM lze také měřit mechanické vlastnosti vezikul, jako je jejich tuhost nebo elasticita, což je užitečné pro porozumění jejich funkčním vlastnostem. V našem portfoliu naleznete celou řadu AFM analyzátorů od společnosti NanoSurf.

Dalšími metodami pro charakterizaci EV jsou fluorescenční korelační spektrospokie (FCS) a mikroskopie se stimulovanou emisní deplecí (STED). FCS využívá fluorescenčních vlastností vezikul a díky fluktuaci fluorescenčního signálu zjišťuje jejich velikost a koncentraci. Je vhodná především pro zkoumání vezikul v interakci s biomolekulami jako například proteiny nebo nukleové kyseliny. Technika STED umožňuje charakterizaci vezikul pod difrakčním limitem běžné fluorescenční mikroskopie a přináší tak extrémně vysoké prostorové rozlišení povrchové struktury a morfologie vezikul.

Charakterizace extracelulárních vezikul vyžaduje kombinaci několika metod a naše firma ANAMET nabízí jejich kompletní portfolio. Pro komplexní analýzu je tedy často nezbytné použít několik technik, které se vzájemně doplňují a díky nám máte tyto techniky po ruce.